本试验使用的水产抗生素包括磺胺嘧啶（SDZ，含量≥98%）、土霉素（OTC，1mg药物效价≥930IU）和恩诺沙星（EFC，含量≥98%）。本试验使用含量为99%的枯草三十七肽购自中农颖泰生物肽公司（中国北京）。本水产养殖试验选用的鱼为尼罗罗非鱼，购自林春渔业公司（中国广州），在自来水水箱中培育3个月并收集样品进行下一步的分析。

试验分为1个对照组和4个试验组。对照组饲料中不含任何抗生素和抗菌肽，各试验组分别添加枯草三十七肽（Cecropin peptide，CP）、SDZ、OTC、EFC（按200mg/kg的含量分别添加到饲料中）。3个月后收集试验各组的水样分别命名为WFF\WCP\WSDZ\WOTC\WEFC，从一个没有罗非鱼的对照水箱中收集水样并标记为WCK基础水样；收集的残留物样品（主要由鱼排泄物组成）分别命名为RFF\RCP\RSDZ\ROTC\REFC；肌肉样品分别标记为FFF\FCP\FSDZ\FOTC\FEFC。

ARGs在罗非鱼养殖系统不同环境中的分布

枯草三十七肽有助于减少耐药菌的丰度；经过枯草三十七肽的处理ARGs在鱼肌肉中迁移的风险相对较低；枯草三十七肽处理的样品中低丰度的intI1可以有效降低ARGs和多重耐药菌的传播风险。

图1 罗非鱼养殖系统水、残留物和鱼肌肉样品中目标ARGs的绝对丰度热图。白色空白表示未检测到。

在鱼的饲料中添加枯草三十七肽可以有效地减少ARGs在鱼肌肉和残留物（主要是粪便）中的积累。而且，在FCP/RCP中所有目标ARGs的总绝对丰度与FFF/RFF相比是比较低的，也证明了枯草三十七肽能有效地减少ARGs的积累。

图2 不同样品中不同类型目标ARGs的总绝对丰度（a）以及所有目标ARGs、16S rRNA和intI1的总绝对丰度（b）。

罗非鱼养殖中不同环境的微生物群落特征

不同抗生素处理样品的OTU数据显著的高于枯草三十七肽处理组和对照组。枯草三十七肽处理组和对照组之间重叠的OTU占枯草三十七肽处理的水/残留物/鱼肌肉样品中总OTU的70%/55.4%/62.5%，说明对照组与枯草三十七肽处理组的微生物群落具有比较相似的结构。不同抗生素处理样品的微生物群落结构也存在一定差异，说明不同的抗生素可能对微生物群群落具有不同的影响。

图3 不同样品主要门类组成（a）、不同处理微生物群落三元图（b）、不同处理样品Circos图（c）、不同样品基于微生物群落的PLS-DA图 （d）。

不同处理下16 S rRNA、intI1、ARGs和菌群的共现网络

对照组、枯草三十七肽处理组和抗生素处理组样品的ARG-ARG、属-属、和ARG-属的共现网络数据之间存在着显著性关联，分别达到了352、250和746。枯草三十七肽的处理有效地降低了ARG-ARG、ARG-属和属-属之间的相关性。

经过枯草三十七肽处理后样品中的多重耐药菌显著减少到3个属，多重耐药菌的减少有利于降低ARGs带来的潜在风险，说明添加枯草三十七肽可能具有控制水产养殖中的ARGs和多重耐药菌产生的作用。

使用抗生素养殖罗非鱼可能会增加ARGs（抗生素耐药基因）和相应的多重耐药菌的风险。

图4 不同样品中intI1、16 S rRNA、靶ARG和属之间的共现网络，对照（a）、枯草三十七肽处理（b）和抗生素处理（c）。红线代表正相关，蓝线代表负相关。

ARGs在水产养殖中可能的影响途径

有直接证据表明不同环境中的ARGs（抗生素耐药基因）受到抗生素的使用（antibiotic usage）、细菌（bacteria）、可移动遗传元件（MGE）及水样水质（water quality）的正向影响；

不同因素对水样ARGs的影响强度顺序为细菌>MGE>使用抗生素>水质；

不同因素对残留物和肌肉样品中ARGs的影响顺序为细菌>MGE>使用抗生素；

使用抗生素对不同环境中ARGs的影响顺序为水样>残留物>鱼肌肉；

PLS-SEM（偏最小二乘结构方程模型）结果进一步证明，在罗非鱼养殖过程中，使用枯草三十七肽代替抗生素可以减少ARGs的产生。

图5 基于偏最小二乘结构方程模型的不同因素对水（a）、残留物（b）和鱼肌肉样本（c）中目标ARGs增殖可能的影响。

使用抗生素会增加耐药基因和多重耐药菌数量，而使用枯草三十七肽处理后多重耐药菌数量比使用抗生素处理减少了75%，枯草三十七肽在控制抗生素耐药基因和多重耐药菌危害方面具有优异的效果。

备注：原文中的天蚕素，主要有效成分为枯草三十七肽。