本试验旨在研究饲料中添加抗菌肽(AMPs)对草鱼肠道形态功能和健康状况的影响。
选择健康，大小相近的草鱼540尾，随机分为6个处理，每个处理3个重复。M0组饲喂基础日粮（对照组，未添加抗菌肽），M1、M2、M3、M4和M5组分别在基础日粮中添加100mg/kg、200mg/kg、400 mg/kg、800 mg/kg和1600 mg/kg抗菌肽，试验期8周。
| 组别 | 日粮 |
| M0 | 基础日粮+0mg/kg |
| M1 | 基础日粮+100mg/kg |
| M2 | 基础日粮+200mg/kg |
| M3 | 基础日粮+400mg/kg |
| M4 | 基础日粮+800mg/kg |
| M5 | 基础日粮+1600mg/kg |
1、抗菌肽对草鱼肠道形态及酶活性的影响
由表1可见，与M0组相比，添加抗菌肽组后肠道淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶水平和总抗氧化能力(T-AOC)显著升高(P< 0.05)，丙二醛(MDA)含量显著降低。组织学分析显示，M4组前肠和中肠绒毛高度和隐窝深度与M0组相比差异显著(P<0.05)。
表1 抗菌肽对草鱼肠道形态及酶活性的影响
数据以mean±SD表示(n=3)，无共同字母的数据差异有统计学意义(P<0.05)。SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；T-AOC：总抗氧化能力。
2、日粮中免疫抗体对肠道免疫相关基因表达的影响
由图1可见，草鱼肠道中锰超氧化物歧化酶（MnSOD）、促炎细胞因子（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素8（IL8）、白细胞介素10（IL10）和转化生长因子β（TGF-β）的表达水平。MnSOD各组无显著差异（图1a）和IL8的表达水平（图1c）在所有组之间无显著差异（P>0.05），但M3的表达水平在所有组中最高。TNF-α的mRNA水平（图1d）在M3中达到峰值（P<0.05）。与其它组相比，M3组IL-1β的表达水平（图1b）显著上调（P<0.05）。随着添加量增加，IL10和TGF-β在草鱼肠道中的表达均先降低，然后缓慢增加，在M3组中达到最低表达水平。IL10的表达水平（图1e）和TGF-β（图1f）在M3组中的表达水平与其它组相比显著下调（P<0.05）。图1（g–k）显示嗜水气单胞菌攻击后，所有组的肠中IL-1β、IL8、TNF-α、IL10和TGF-α的mRNA水平。与对照组相比，添加抗菌肽组M0-Ah中IL-1β的表达水平显著增加（P<0.05）。与M0-M2相比，M3、M4和M5IL8（图1h）和TNF-α（图1i）的表达有显著下调趋势（P<0.05）。IL10的mRNA水平没有显著差异（图1j）在所有组之间（除M1-Ah外）（P>0.05）。草鱼肠道中，TGF-β的表达水平（图1k）在M3-Ah达到峰值，与其他组相比有显著差异（P<0.05）。
图1.饲喂AMP (a-e)和攻毒嗜水单胞菌(g-k)后草鱼肠道免疫相关基因的表达结果针对β-肌动蛋白归一化。数据以mean±SD表示(n = 3)。
3、肠道微生物区系的优势细菌类群
3.1 肠道菌群的多样性和丰富性
各组Shannon、Simpson、Chao和Ace指数没有显著差异（图2a-d），而在Shannon指数中，NC组和M5-Ah与M0-Ah相比，显著增加（图2e）；在Ace指数（图2g）和Chao（图2h）指数中，与NC组相比，M2-Ah、M3-Ah和M4-Ah显著降低。β多样性分析的结果可以反映物种组成在不同类群中的分布。因此，不同样本中微生物群落的相似性或差异性可以使用主坐标分析（PCoA）来识别，这是β多样性分析之一（图2ij）。结果（图2i）显示，在从M0中分离出来的所有添加抗菌肽组（M3除外）中都有一些相似的组成，图2j显示了M1至M5-Ah中比M0和NC组更多的重叠元素。
图2.各组肠道菌群的多样性和丰富性
3.2 肠道菌群的相对丰度
如图3、图4所示，变形菌门、厚壁菌门和梭杆菌门的群落丰度约占各组细菌总数的80%，梭杆菌门的丰度最小，而厚壁菌门、拟杆菌门和蓝藻门在M4中最高（图3a）、（图4a）相对于其它各组。放线菌的群落丰度在M0中最高（图3a），在M1中最低（图3a）。在攻毒组中，放线菌在M0-Ah中的比例最低（图4a）。衣原体在M0中的丰度最高（图3a），其比例高于其它组，而酸杆菌在M4中最高（图3a），在其它组中很少。图3表明，与M0相比，添加抗菌肽组中浮游菌的相对丰度显著下调（P<0.05）（图3b），并在M3中达到最低水平（图3b）。图3c和g显示M1和M5中浮游菌的相对丰度显著降低（P<0.01），蓝藻门的相对丰度。与M0组相比显著增加（P<0.05）。此外，厚壁菌门的相对丰度在M3（p<0.01）和M4（P<0.05）中显著增加，其中浮霉菌门的相对丰度比M0显著降低（P<0.01）（图3e-f）。M2和M0之间没有显著差异（图3d）。酸杆菌门在NC组中的相对丰度显著高于M0-Ah、M2-Ah、M3-Ah和M4-Ah（P<0.05）。此外，与M0-Ah相比，M4-Ah中梭杆菌门的相对丰度显著降低（P<0.05）。
图3.通过单因素方差分析比较六组肠道菌群的相对丰度
(a):门水平;(b):各组植物菌的相对丰度;(c): M0和M1的相对丰度;(d) M0和M2的相对丰度;(c): M0和M3的相对丰度;(d): M0和M4的相对丰度;(e): M0和M5的相对丰度。
图4.通过单因素方差分析比较嗜水单胞杆菌攻毒组肠道菌群的相对丰度
(a):门水平;(b): NC和M0-Ah的相对丰度;(c): NC和M1-Ah的相对丰度;(d) NC和M2-Ah的相对丰度;(e): NC和M3-Ah的相对丰度;(f): NC和M4-Ah的相对丰度;(g): NC和M5-Ah的相对丰度;(h): M0-Ah和M1-Ah的相对丰度;(i): M0-Ah和M2-Ah的相对丰度;(j) M0-Ah和M3-Ah的相对丰度;(k): M0-Ah和M4-Ah的相对丰度;(l): M0-Ah和M5-Ah的相对丰度。
3.4 肠道菌群组成与免疫相关基因的相关性研究
如图5所示，螺旋体门和异常球菌-栖热菌门的相对丰度与IL-1β、MnSOD和TNF-α的表达水平呈显著正相关（P<0.05），而蓝藻门和硝化螺旋菌门分别与IL10和IL-1β的表达水平呈明显正相关（P<0.05）。此外，变形菌门和异常球菌-栖热菌门的相对丰度与IL8的mRNA表达水平之间存在显著的正相关关系（P<0.05）。图5b显示，梭杆菌和衣原体的相对丰度与IL-1β的mRNA表达水平呈显著正相关（P<0.05），但是，与酸杆菌和软壁菌门呈显著负相关（P<0.05），髌骨细菌门与IL8呈负相关。
图5.免疫防御系统相关基因与培养组(a)和攻毒组(b)肠道微生物相对丰度在门水平上的相关性Pearson相关系数由不同颜色体现(青色黑色:正相关;紫色:负相关)。
本研究表明，在饲料中添加400~800 mg/kg的抗菌肽可以改善草鱼肠道结构，增加草鱼肠道菌群的多样性。此外，抗菌肽还能抑制某些致病菌，如嗜水气单胞菌，增加厌氧菌数量，提高肠道对营养物质的吸收能力。但极高的剂量会抑制肠道消化、营养吸收能力和微生物多样性。抗菌肽已被应用于水产养殖以增强健康，但其与水生生物肠道菌群的相互作用还有待进一步探索。
参考文献
Shulin Liu,Shaodan Wang,Xuewei Liu, et al. Effects of dietary antimicrobial peptides on intestinal morphology, antioxidant status, immune responses, microbiota and pathogen disease resistance in grass carp Ctenopharyngodon idellus. Microbial Pathogenesis. 2022;165 (0):105386-105386.
翻译：宋志恒
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